Summary
Polysaccharides are polymeric carbohydrate macromolecules composed of long chains of monosaccharide joined by glycosidic linkages. A lot of attempts have been made for the polymers since it has been reported that polysaccharides have significant biological activities such as anti cancer, immunomodulating, anti oxidant, antimicrobial activities. In order to get insight into the biological activities as well as control quality of natural herb and commercial products from polysaccharide, analytical tools have been developed for qualitative and quantitative analysis of the compounds. The method involved determination of molecular weight, enzyme-digestion, select oligosaccharide fingerprint, oligosaccharide marker have been applied together with systems such as HPGPC, GC, NMR, MALDI-TOF-MS. With advanced technique and equipments, it becomes possible to identify and control the quality of the polysaccharide products.
Key words: Polysaccharide, oligosaccharide fingerprint, oligosaccharide marker, enzyme-digestion
1. Đặt vấn đề
Polysaccharide là hợp chất cao phân tử của carbohydrate bao gồm đơn phân là các monosaccharide nối với nhau bằng liên kết glycosidic. Chúng là những đại phân tử có vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng và phát triển của động thực vật. Trong tự nhiên, polysachride được tìm thấy ở hầu hết tế bào sinh vật bao gồm cả vi sinh vật. Polysaccharide có hai loại bao gồm loại được tạo thành từ một loại monosaccharide và loại được tạo thành từ nhiều monosaccharide khác nhau. Một số polysaccharide có cấu trúc mạch thẳng trong khi số khác lại có cấu trúc mạch nhánh. Điều này tào lên sự phong phú và đa dạng trong cấu trúc và tính chất của polysaccharide.[1]
Trong những năm vừa qua, nhiều polysaccharide của các loại cây trồng, dược liệu trong tự nhiên được tách chiết, phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá tác dụng sinh học. Các polysaccharide được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học như tác dụng chống ung thư, điều hòa hệ miễn dịch, chống viêm, chống oxy hóa.[2] Một số polysacchride như β-glucan, fucoidan (sulfate polysaccharide) đã được chứng minh có tác dụng hiệu quả trong tăng cường hệ miễn dịch, hỗ trợ điều trị bệnh ung thư.[3] Zymosan, một loại β-glucan được chứng minh có khả năng kích thích tế bào biểu hiện kháng nguyên như thụ thể giống toll (TLR) để điều chỉnh quá trình tiết các cytokine trong tế bào hình sao và thực bào như Interleukin-6 (IL-6), IL-10, IL-12 góp phần vào quá trình điều hòa hệ miễn dịch khi phản ứng với các tác nhân từ bên ngoài.[4]
Để xác định được cấu trúc, thành phần và hàm lượng của các polysaccharide phục vụ công tác nghiên cứu, phát triển và đảm bảo chất lượng sản phẩm thực phẩm, dược phẩm thì việc xây dựng và phát triển các phương pháp phân tích kiểm nghiệm nhóm hợp chất này là rất cần thiết. Tuy nhiên, thực tế cho thấy, phân tích thành phần và hàm lượng của polysaccharide gặp nhiều khó khăn do thông thường các polysaccharide tồn tại dưới dạng hỗn hợp với nhiều thành phần khác nhau. Do đó, việc phân tách các thành phần này sẽ cho kết quả với độ lặp lại thấp. Hơn nữa, polysaccharide có khối lượng phân tử lớn và có độ phân cực cao nên không phù hợp với các phương pháp sắc ký sử dụng cho các chất có khối lượng phân tử thấp. Ngoài ra, polysaccharide không có đặc tính hấp thụ tia UV và khó bị ion hóa nên khi phân tích bằng các detector UV và MS sẽ khó áp dụng được. Gần đây, việc áp dụng một số detector như RI, CAD/ELSD cũng cho độ nhạy thấp. Điều này đặt ra một thách thức lớn trong việc xây dựng và phát triển các phương pháp phân tích polysaccharide.[5] Trong bài viết này, chúng tôi sẽ đi tổng quan quá trình phát triển các phương pháp phân tích định tính và định lượng polysachride. Các thành tựu mới nhất, các hướng tiếp cận tiềm năng để xây dựng phương pháp phân tích phù hợp nhất cho các chất polysaccharide phục vụ cho nghiên cứu và phát triển sản phẩm từ nguồn polysaccharide trong tự nhiên.
2. Phương pháp phân tích định tính polysacharide
Phương pháp phân tích định tính polysaccharide thường liên quan đến các kỹ thuật xác định khối lượng phân tử của các thành phần trong đại phân tử, tỷ lệ các loại đường đơn, liên kết glycosidic. Phương pháp phổ biến để xác định cấu trúc polysaccharide là sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi chi phí lớn và yêu cầu mẫu phân tích phải có độ tinh khiết cao. Mặt khác, khi sử dụng hệ thống NMR để phân tích sẽ có nhiều tín hiệu nhiễu ảnh hưởng đến kết quả phân tích polysaccharide. Đặc biệt, polysaccharide có độ nhớt cao và tan kém trong dung dịch D2O dẫn đến các tin hiệu peak của hợp chất này khó đạt được yêu cầu về chất lượng peak trong thử nghiệm.[6]
Việc xác định cấu trúc toàn bộ phân tử polysaccharide rất khó khăn do nhóm chất này có khối lượng phân tử lớn, cấu trúc phức tạp. Hiện nay, người ta thường sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao dựa trên kích thước hạt phân tử (HPSEC) được sử dụng để phân tách các polysaccharide trong hỗn hợp và sử dụng các polysaccharide chuẩn làm chỉ thị để phát hiện. Phương pháp này được áp dụng để định tính một số polysaccharide trong nấm dược liệu và cho kết quả tốt với ưu điểm là việc chuẩn bị mẫu đơn giản. Wu và cs đã nghiên cứu áp dụng phương pháp HPSEC kết hợp với tán xạ tia laser đa góc (MALLS) và detector bức xạ (RID) để định tính polysaccharide trong cây Cẩu kỳ tử (Lycium barbarum). Phương pháp này có thể xác định được số lượng và khối lượng phân tử của các polysaccharide trong dược liệu trên. HPSEC-MALLS-RID có thể sử dụng để đánh giá chất lượng các polysaccharide trong các mẫu dược liệu trong tự nhiên.[7] Guan và cs sử dụng một số enzyme đặc hiệu endo-carbohydrase như glucanase, arabinanase, xylanase, galactanase, cellualse, amylase, pectinase để phân cắt các polysaccharide sau đó áp dụng HPSEC và HPLC sau khi dẫn xuất hóa để xác định các loại polysaccharide trong các cây dược liệu. Kết quả đã xây dựng được dữ liệu các monomer của từng loại polysaccharide từ đó phân biệt được cấu trúc của các loại polysachide đặc trưng của các loại dược liệu.[8] Li và cs đã chiết xuất, tinh chế và xác định chỉ thị polysaccharide trong Đông trùng hạ thảo (cordyceps). Nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp NMR, HPGPC-CAD, sắc ký khí khối phổ (GC-MS) để xác định thành phần, cấu trúc của các phân tử polysaccharide. Kết quả đã xác định được một chỉ thị polysaccharide đặc trưng cho các loài Đông trùng hạ thảo. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu sinh học phân tử của các loài nấm này cho thây việc xây dựng chỉ thị phân tử polysaccharide có thể sử dụng để đánh giá chất lượng, xác định nguồn gốc và đặc tính của các loài nấm này.[9] Tuy nhiên, trong các trường hợp trên, việc sử dụng cột sắc ký dựa trên kích thước hạt gặp nhiều khó khăn trong việc phân tách các phân tử polysaccharide ban đầu do tạo ra các peak quá rộng và không đặc hiệu. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng, polysaccharide bị phân hủy trong quá trình xử lý mẫu đặc biệt khi sử dụng phương pháp chiết siêu âm.[10] Do đó, việc để phân tích polysaccharide cần phải thủy phân các phân tử lớn thành các tiểu phần bằng hóa học hoặc enzyme từ đó phân tích thành phần và khối lượng phân tử của chúng.[10]
Phân tích thành phần các monomer trong polysaccharide
Để định tính các polysaccharide, phân tích các monomer của đại phân tử này sẽ dễ dàng và khả thi hơn so với phân tích phân tử polysaccharide ban đầu. Chính vì thế, việc phân tích từng monomer và xác định chỉ thị nhận biết phân tử được áp dụng để định tính polysaccharide trong dược liệu. Tuy nhiên, phương pháp này có một số hạn chế như độ đặc hiệu thấp do trong thực tế các polysaccharide có cấu trúc monomer khá phức tạp và đa dạng. Một hạn chế của phương pháp thủy phân polysaccharide là mức độ phân cắt các polysaccharide thành các monomer. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng, polysaccharide có uronic acid dễ dàng bị thủy phân hơn các polysaccharide chứa amino acid.[11] Liên kết β-(1,3) trong phân tử β-glucan của yến mạch kém ổn định hơn so với liên kết β-(1,4).[12] Việc khử amin sau khi thủy phân bằng acid các polysaccharide có thể tăng hiệu quả phân cắt các polysaccharide được methyl hóa.[13] Các kết quả trên chỉ ra rằng, các phương pháp thủy phân không tối ưu có thể dẫn đến việc thủy phân không triệt để các polysaccharide. Các acid mạnh thường được sử dụng để phân cắt hoàn toàn các liên kết glycosidic trong phân tử polysaccharide. Tuy nhiên, các acid mạnh có thể làm chuyển đổi các dạng monomer hoặc chuyển đường thành các hợp chất khác như fufurals.[14] Do đó, phương pháp thủy phân hai giai đoạn gồm tăng nhiệt theo chu trình và sử dụng vi sóng đạt được hiệu quả phân cắt polysaccharide thành các monomer. Sự cân bằng giữa hiệu quả phân cắt và tỷ lệ cấu trúc phân tử bị phá vỡ là yếu tố cần quan tâm khi xây dựng quy trình thủy phân polysaccharide.[15] Một hạn chế của phương pháp xác định các monomer của polysaccharide bằng các kỹ thuật sắc ký như sắc ký tương tác phân cực (HILIC) và sắc ký trao đổi ion là các kỹ thuật này không phân tách được giữa glucose và galactose và arabinose và xylose. Do đó, các nghiên cứu thường sử dụng phương pháp tạo dẫn suất với 1-phenyl-3-methyl-5-pyranzolone để tăng hiệu quả phân tách qua cột và tạo cho các dẫn suất có khả năng hấp thụ tia UV. [16][17]
Xác định chỉ thị dấu vân tay các oligosaccharide
Việc xác định dấu vân tay oligosaccharide là một trong những kỹ thuật giúp nắm được đặc điểm các loại polysachaide đặc trưng cho mỗi loại sản phẩm. Kỹ thuật này bao gồm ba bước sau: bước 1 là thủy phân một phần polysaccharide mục tiêu bởi enzyme hoặc các hóa chất để tạo thành các oligomer; bước 2 tạo dẫn xuất của các sản phẩm thủy phân và phân tích bằng các kỹ thuật như khối phổ sử dụng tia laser và chất nền (MALDI-MS) hoặc điện di gel carbohydrate (PACE), sắc ký bản mỏng hiệu năng cao (HPTLC), điện di mao quản (CE); bước ba là phân tích số liệu dựa trên các thông tin khoa học và cơ sở dữ liệu. Trong khoảng chục năm vừa qua, phương pháp tạo bản đồ saccharide được xây dựng và áp dụng rộng rãi trong việc xác định đặc tính hóa học và phân biệt các loại polysaccharide trong nhiều mẫu dược liệu.
Sun và cs áp dụng hệ thống HPLC-ELSD để xác định dấu vân tay saccharide trong củ Ba kích (Morindae officinalis). Kết quả dấu vân tay chỉ ra 26 hợp chất phổ biến trong rễ của các loài Ba kích được thu thập ở các địa điểm khác nhau với độ lặp lại trên 0,926. Kết quả này cho thấy có thể áp dụng phương pháp sắc ký vân tay để xác định và đánh giá chất lượng dươc liệu Ba kích.[18] Phương pháp điện di gel carbohydrate (PACE) kết hợp với tạo dẫn xuất với 2-aminoacridone (AMAC) và 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid (ANTS) được nghiên cứu và ứng dụng trong việc xác định dấu vân tay của polysaccharide thành tế bào và dạng thủy phân của chúng. Các polysaccharide được thủy phân bằng các enzyme đặc hiệu trước khi chạy điện di. Kết quả cho thấy, PACE có độ nhạy cao trong việc xác định các monosaccharide trong phân tử polysaccharide thành tế bào. Đồng thời, kết hợp với sử dụng các enzyme thủy phân có thể xác định được cấu trúc của polysaccharide ban đầu. Mặt khác, PACE có độ nhạy cao với khả năng phát hiện các monosaccharide ở nồng độ 500 fmol và 100 fmol với oligosaccharide.[19] Tuy nhiên, các kỹ thuật trên cũng có một số hạn chế trong phân tích polysaccharide như: độ lặp lại thấp do việc chuẩn bị gel được thực hiện thủ công dẫn đến có sự khác nhau giữa các phòng nghiên cứu; thời gian để thực hiên phản ứng thủy phân bằng enzyme thường kéo dài nhiều giờ và việc xác định bằng oligosaccharide cần phải có các chuẩn hỗn hợp trong khi các chuẩn này rất ít trong thực tế.
Sự ra đời và phát triển của công nghệ MALDI-MS sử dụng thiết bị phân tích dựa trên thời gian bay của hạt (TOF) đã tạo ra một công cụ hữu ích trong việc xác định chỉ thị vân tay của polysaccharide. MALDI-TOF-MS xác định các polysaccharide dựa trên các ion tạo ra do sự cắt đứt các liên kết glycosidic và các mảnh phân tử bị đứt gãy do tia laser. Đây là một công cụ có độ nhạy cao, thời gian phân tích ngắn và có thể phân tích nhiều loại polysaccharide tại một thời điểm.[20] Wang và cs áp dụng hệ thống MALDI-TOF-MS để xác định các monosaccharide trong polysaccharide từ Đông trùng hạ thảo. Sắc ký đồ khối phổ chỉ ra các peak tương ứng với sự có mặt của các loại monosaccharide như hexose, các đường đơn 5 carbon như arabinose, xylose không tìm thấy trong cấu trúc của polysaccharide này. Khối lượng phân tử của polysaccharide là 4901 đơn vị. [21] MALDI-TOF-MS có thể được áp dụng trong việc đánh giá và kiểm soát nhanh chất lượng dược liệu. Wang và cs đã sử dụng công nghệ này để phân tích nhanh polysaccharide trong các dược liệu họ Hoàng kỳ (astragalus). Các mẫu phân tích đều cho kết quả về khối lượng trung bình phân tử cũng như các monosaccharide đặc trưng của polysaccharide trong loại dược liệu này. Các thông tin này là những chỉ thị vân tay để kiểm soát và đánh giá nhanh chất lượng các mẫu dược liệu Hoàng kỳ.[22]
3. Các phương pháp phân tích định lượng polysacharide
Cho đến nay, để định lượng polysaccharide, phenol-sulfuric acid được xem là phương pháp đơn giản và phổ biến nhất đang được áp dụng. Phương pháp này dựa trên việc phản ứng giữa phenol, sulfuric acid với đường để tạo thành sản phẩm có màu. Màu sắc của sản phẩm tỷ lệ với nồng độ glucose trong dung dịch. Sử dụng máy so màu UV-VIS ở bước sóng 510nm để đo độ hấp thụ của mẫu với mẫu glucose chuẩn.[23] Mặc dù được dùng phổ biến nhưng phương pháp này có một số nhược điểm như độ chính xác và độ đặc hiệu thấp. Do chất chuẩn chỉ là glucose nên khi phân tích các polysachardie phức tạp với nhiều loại monosaccharide khác nhau sẽ dẫn đến sai số của phương pháp lớn. Phương pháp định lượng dựa trên việc xác định tổng monosaccharide cũng đã được giới thiệu. người ta sử dụng acid để thủy phân các polysaccharide tạo thành các đường đơn và đường mạch ngắn. Sau đó phân tích bằng các hệ thống sắc ký lỏng dựa trên kích thước phân tử, trao đổi ion. Tuy nhiên phương pháp này phụ thuộc vào hiệu suất quá trình thủy phân, độ chính xác thấp và không đặc hiệu. Các hàm lượng của monosaccharide chưa đủ thông tin để kết luận hàm lượng polysachride.[24] Nhìn chung, các phương pháp trên chỉ phù hợp để xác định hàm lượng polysaccharide tổng số. Việc xác định chính xác loại và hàm lượng của polysaccharide đòi hỏi các cách tiếp cận chi tiết hơn đó là sử dụng các chỉ thị oligosaccharide và chỉ thị polysaccharide.
Định lượng polysaccharide dựa trên chỉ thị polysaccharide
Phương pháp này dựa trên việc sử dụng polysaccharide mục tiêu làm chất chỉ thị để xác định hàm lượng polysachride trong mẫu. Xu và cs sử dụng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (HPGPC) để phân tích định tính và định lượng các thành phần saccharide trong cây Thạch hộc (Dendrobium officinale). Phương pháp xác định được một polysaccharide đặc trưng cho các mẫu Thạch Hộc. Sử dụng polysaccharide này để thẩm định phương pháp cho độ tuyến tính, độ thu hồi tốt. Điều đó cho thấy, sử dụng chỉ thị polysachride mục tiêu có thể áp dụng để định lượng polysaccharide.[25] Trong phương pháp sử dụng chỉ thị polysaacharide mục tiêu, người ta tiến hành chiết tách mẫu sau đó tiến hành phân tích bằng hệ thống sắc ký ELSD hoặc CAD mà không phải qua các bước xử lý mẫu như thủy phân hay tạo dẫn suất. Do đó, kỹ thuật này có độ chính xác, ổn định, và hiệu quả hơn. Tuy nhiên phương pháp này khó áp dụng cho nhiều loại polysaccharide do tính phức tạp của cấu trúc các polysaccharide cũng như ảnh hưởng của các thành phần khác trong nền mẫu. Một số nhà khoa học đã sử dụng cách tiếp cận này để định lượng polysaccharide mà không cần phải các chất chuẩn. Deng và cs sử dụng kỹ thuật sắc ký dựa trên kích thước phân tử với detector tán xạ đa góc và chỉ số khúc xạ (HPSEC-MALLS-RID), sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS), NMR và điện di gel (PACE) để định lượng polysachride trong cây Hoàng thảo (Dendrobium huoshanense) dựa trên chỉ thị polysaccharide mục tiêu. Phương pháp đã xác định được một số polysachride chỉ thị cho loài dược liệu này. Các polysaccharide này được phân tích cấu trúc, thành phần đường đơn, liên kết phân tử. Sự đồng nhất về kết quả giữa các mẫu cho thấy phương pháp này có thể dùng để kiểm tra và kiểm soát chất lượng dược liệu.[26] Graiff và cs sử dụng LC-MS để xác định hàm lượng polysachride laminarin trong tảo tím. Polysacharide được phân tích trực tiếp bằng LC-MS đã xác định được một số polysachride có khối lượng phân tử từ 2000 đến 7000 Da. Sử dụng chuẩn laminarin và LC-MS đã định lượng được polysachride này trong một số mẫu tảo cho thấy phương pháp này có thể áp dụng để định lượng polysaccharide.[27] Tuy nhiên phương pháp dựa trên polysaccharide mục tiêu khó áp dụng đối với nền mẫu chứa nhiều loại polysaccharide như các mẫu dược liệu, thực phẩm bảo vệ sức khỏe.
Định lượng polysaccharide dựa trên chỉ thị oligosaccharide
Việc sử dụng chỉ thị oligosaccharide trong định lượng polysaccharide sẽ khắc phục được nhược điểm của chỉ thị monosaccharide do chúng mang những đặc điểm liên quan đến cấu trúc để cấu tạo lên đại phân tử polysaccharide. Các oligosaccharide có thể được định lượng bằng một số phương pháp. Nếu có mối tương quan giữa hàm lượng polysaccharide ban đầu với hàm lượng các đoạn oligosaccharide được tạo thành thì có thể tính polysaccharide dựa trên diện tích peak của chỉ thị oligosaccharide. Để thực hiện được phương pháp này, người ta tiến hành theo ba bước: bước 1 là chuẩn bị một chất chuẩn polysaccharide và xác định đặc tính của nó; bước 2 là lựa chọn chỉ thị oligosaccharide; bước 3 là thiết lập mối tương quan giữa chỉ thị oligosaccharide và polysaccharide và thẩm định phương pháp. Trước tiên, các oligosaccharide được tạo thành từ quá trình thủy phân có kiểm soát các polysaccharide định phân tích. Sau đó tiến hành lựa chọn chỉ thị oligosaccharide thỏa mãn yêu cầu về độ chính xác và độ đặc hiệu cho định tính và định lượng polysaccharide đó. [5] Wong và cs xây dựng phương pháp định tính và định lượng polysaccharide trong mẫu cây Thạch hộc (Dendrobium officinale) dựa trên việc tạo ra các chỉ thị oligosaccharide bằng cách thủy phân polysaccharide từ mẫu cây sau đó tiến hành tạo dẫn xuất với p-aminobenzoic ethyl ether và phân tích bằng sắc ký lỏng khối phổ. Kết quả nghiên cứu đã chọn được 2 chỉ thị oligosaccharide với độ đặc hiệu tốt. Mối tương quan thuận giữa hàm lượng chỉ thị với hàm lượng polysaccharide ban đầu cho phép sử dụng chỉ thị oligosaccharide trên để xác định hàm lượng polysaccharide trong cây Thạch hộc. Phương pháp được thẩm định với độ lặp lại, tỷ lệ thu hồi, độ tuyến tính cao. Do đó có thể sử dụng chỉ thị này trong phân tích hàm lượng polysaccharide trong Thạch hộc.[28] Việc tạo ra các chỉ thị oligosaccharide sẽ góp phần tạo ra các công cụ để đánh giá chất lượng dược liệu chứa polysaccharide. Li và cs đã nghiên cứu xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng polysaccharide trong bài thuốc đông y Trung quốc với hai thành phần là Hoàng kỳ (Astragali radix) và Đương quy (Angelicae sinensis radix). Quy trình dựa trên việc chiết tách polysaccharide trong bài thuốc, tiếp đến là thủy phân polysaccharide để tạo thành oligosaccharide, tạo dẫn xuất với ethyl p-aminobenzoate, lựa chọn và thu nhận chỉ thị bằng hệ thống sắc ký lỏng điều chế, xác định cấu trúc phân tử, xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng polysaccharide dựa trên chỉ thị oligosaccharide đã lựa chọn. Kết quả đã lựa chọn được hai chỉ thị oligosaccharide đại diện cho polysaccharide trong hai loại dược liệu trên. Kết quả thẩm định phương pháp cho thấy có sự tuyến tính giữa hàm lượng chỉ thị oligosaccharide và polysaccharide, độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp đạt yêu cầu. Do đó, có thể sử dụng hai chỉ thị oligosaccharide tìm được để xác định hàm lượng và đánh giá chất lượng polysaccharide trong bài thuốc đông y Trung quốc có chứa hai loại dược liệu trên.[29] Với cách tiếp cận tương tự được Cheng và cs thực hiện trên các mẫu sản phẩm từ tổ yến. Nhóm nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định thành phần agar trong các sản phẩm từ yến sào trên thị trường. Để định tính và định lượng agar trong sản phẩm, các mẫu được thủy phân có kiểm soát để tạo thành các oligosaccharide sau đó tạo dẫn suất với p-aminobenzoic ethyl ester và phân tích bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-QTOF-MS). Có khoảng 24 oligosaccharide được thu nhận và xác định đặc trưng cho các loại agar và được coi là các chỉ thị để định tính agar. Trong số đó, nhóm nghiên cứu đã chọn được một oligosaccharide có tín hiệu peak cao nhất và thể hiện sự tuyến tính với chất chuẩn agar. Chỉ thị này được lựa chọn để xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng agar dựa trên chỉ thị oligosaccharide. Kết quả thẩm định cho thấy các chỉ số về độ tuyến tính, độ chính xác, độ chụm, độ lặp lại đạt yêu cầu. Điều đó cho thấy phương pháp định lượng polysaccharide dựa trên chỉ thị oligosaccharide có thể thực hiện để kiểm soát chất lượng các sản phẩm thương mại có thành phần aga cũng như các polysaccharide khác.[30] So với các phương pháp định lượng polysaccharide đã trình ở trên, phương pháp định lượng polysaccharide dựa trên chỉ thị oligosaccharide có nhiều ưu điểm hơn trong việc định lượng polysaccharide trong hỗn hợp với độ chính xác và tin cậy cao. Đây sẽ là định hướng để phát triển các phương pháp định lượng polysaccharide trong các nền mẫu phức tạp như dược liệu, các sản phẩm thực phẩm, thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗn hợp.
4. Kết luận
Polysaccharide là hợp chất cao phân tử có nhiều trong các loài động thực vật tự nhiên với nhiều tác dụng sinh học quan trọng. Tuy nhiên việc phân tích định tính và định lượng nhóm hợp chất này gặp nhiều khó khăn do tính phức tạp về thành phần và cấu trúc của đại phân tử này. Hiện nay nhiều phương pháp, kỹ thuật đã được nghiên cứu và áp dụng để định tính và định lượng polysaccharide trong tự nhiên cũng như trong các sản phẩm thương mại hóa. Các phương pháp này liên quan đến việc xác định và định lượng các monosaccharide hoặc oligosaccharide cấu tạo lên phân tử polysaccharide cũng như dùng chính polysachride mục tiêu làm chỉ thị để xác định. Mỗi phương pháp có những ưu nhược điểm riêng. Tuy nhiên sự phát triển của các phương pháp trên đã tạo ra công cụ hữu ích trong nghiên cứu và kiểm soát chất lượng sản phẩm polysaccharide.
Tài liệu tham khảo
[1] J. H. Xie et al., “Advances on Bioactive Polysaccharides from Medicinal Plants,” Crit. Rev. Food Sci. Nutr., vol. 56, pp. S60–S84, 2016, doi: 10.1080/10408398.2015.1069255.
[2] Y. Yu, M. Shen, Q. Song, and J. Xie, “Biological activities and pharmaceutical applications of polysaccharide from natural resources: A review,” Carbohydr. Polym., vol. 183, no. 235, pp. 91–101, 2018, doi: 10.1016/j.carbpol.2017.12.009.
[3] J. O. Jin, M. G. Song, Y. N. Kim, J. I. Park, and J. Y. Kwak, “The mechanism of fucoidan-induced apoptosis in leukemic cells: Involvement of ERK1/2, JNK, glutathione, and nitric oxide,” Mol. Carcinog., vol. 49, no. 8, pp. 771–782, 2010, doi: 10.1002/mc.20654.
[4] S. Dillon et al., “Yeast zymosan, a stimulus for TLR2 and dectin-1, induces regulatory antigen-presenting cells and immunological tolerance,” J. Clin. Invest., vol. 116, no. 4, pp. 916–928, 2006, doi: 10.1172/JCI27203.
[5] L. F. Li, Q. W. Zhang, and Q. Bin Han, “Recent advances in qualitative and quantitative analysis of polysaccharides in natural medicines: A critical review,” J. Pharm. Biomed. Anal., vol. 220, no. August, p. 115016, 2022, doi: 10.1016/j.jpba.2022.115016.
[6] T. L. Wong et al., “Oligosaccharide analysis of the backbone structure of the characteristic polysaccharide of Dendrobium officinale,” Food Hydrocoll., vol. 134, no. July 2022, p. 108038, 2023, doi: 10.1016/j.foodhyd.2022.108038.
[7] D. T. Wu et al., “Simultaneous determination of molecular weights and contents of water-soluble polysaccharides and their fractions from Lycium barbarum collected in China,” J. Pharm. Biomed. Anal., vol. 129, pp. 210–218, 2016, doi: 10.1016/j.jpba.2016.07.005.
[8] J. Guan and S. P. Li, “Discrimination of polysaccharides from traditional Chinese medicines using saccharide mapping-Enzymatic digestion followed by chromatographic analysis,” J. Pharm. Biomed. Anal., vol. 51, no. 3, pp. 590–598, 2010, doi: 10.1016/j.jpba.2009.09.026.
[9] L. F. Li et al., “A specific and bioactive polysaccharide marker for Cordyceps,” Carbohydr. Polym., vol. 269, no. June, p. 118343, 2021, doi: 10.1016/j.carbpol.2021.118343.
[10] S. Li et al., “Effect of ultrasonic degradation on the physicochemical property and bioactivity of polysaccharide produced by Chaetomium globosum CGMCC 6882,” Front. Nutr., vol. 9, no. July, pp. 1–10, 2022, doi: 10.3389/fnut.2022.941524.
[11] Q. C. Wang, X. Zhao, J. H. Pu, and X. H. Luan, “Influences of acidic reaction and hydrolytic conditions on monosaccharide composition analysis of acidic, neutral and basic polysaccharides,” Carbohydr. Polym., vol. 143, pp. 296–300, 2016, doi: 10.1016/j.carbpol.2016.02.023.
[12] H. S. H. Nguyen, J. Heinonen, M. Laatikainen, and T. Sainio, “Evolution of the molar mass distribution of oat β-glucan during acid catalyzed hydrolysis in aqueous solution,” Chem. Eng. J., vol. 382, p. 122863, 2020, doi: 10.1016/j.cej.2019.122863.
[13] D. Lorenz, R. Janzon, and B. Saake, “Determination of uronic acids and neutral carbohydrates in pulp and biomass by hydrolysis, reductive amination and HPAEC-UV,” Holzforschung, vol. 71, no. 10, pp. 767–775, 2017, doi: 10.1515/hf-2017-0020.
[14] Y. Shi, T. Yokoyama, T. Akiyama, M. Yashiro, and Y. Matsumoto, “Degradation kinetics of monosaccharides in hydrochloric, sulfuric, and sulfurous acid,” BioResources, vol. 7, no. 3, pp. 4085–4097, 2012, doi: 10.15376/biores.7.3.4085-4097.
[15] H. Shi et al., “Two-step hydrolysis method for monosaccharide composition analysis of natural polysaccharides rich in uronic acids,” Food Hydrocoll., vol. 101, p. 105524, 2020, doi: 10.1016/j.foodhyd.2019.105524.
[16] J. Yan et al., “Neutral monosaccharide composition analysis of plant-derived oligo- and polysaccharides by high performance liquid chromatography,” Carbohydr. Polym., vol. 136, pp. 1273–1280, 2016, doi: 10.1016/j.carbpol.2015.10.028.
[17] A. Harazono et al., “A comparative study of monosaccharide composition analysis as a carbohydrate test for biopharmaceuticals,” Biologicals, vol. 39, no. 3, pp. 171–180, 2011, doi: 10.1016/j.biologicals.2011.04.002.
[18] H. Sun et al., “Chemical fingerprint analysis and quantitative analysis of saccharides in morindae officinalis radix by HPLC-ELSD,” Molecules, vol. 26, no. 23, pp. 1–14, 2021, doi: 10.3390/molecules26237242.
[19] F. Goubet, P. Jackson, M. J. Deery, and P. Dupree, “Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis. A method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases,” Anal. Biochem., vol. 300, no. 1, pp. 53–68, 2002, doi: 10.1006/abio.2001.5444.
[20] S. Nicolardi et al., “Analysis of synthetic monodisperse polysaccharides by wide mass range ultrahigh-resolution maldi mass spectrometry,” Anal. Chem., vol. 93, no. 10, pp. 4666–4675, 2021, doi: 10.1021/acs.analchem.1c00239.
[21] J. Wang et al., “Structural characterization and immunostimulatory activity of a glucan from natural Cordyceps sinensis,” Food Hydrocoll., vol. 67, pp. 139–147, 2017, doi: 10.1016/j.foodhyd.2017.01.010.
[22] H. Wang, X. Zhao, Y. Huang, J. Liao, Y. Liu, and Y. Pan, “Rapid quality control of medicine and food dual purpose plant polysaccharides by matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry,” Analyst, vol. 145, no. 6, pp. 2168–2175, 2020, doi: 10.1039/c9an02440a.
[23] S. S. Nielsen, Phenol-Sulfuric Acid Method for Total Carbohydrates. 2010. doi: 10.1007/978-1-4419-1463-7_6.
[24] J. M. François, “A simple method for quantitative determination of polysaccharides in fungal cell walls,” Nat. Protoc., vol. 1, no. 6, pp. 2995–3000, 2007, doi: 10.1038/nprot.2006.457.
[25] J. Xu et al., “A novel and rapid HPGPC-based strategy for quality control of saccharide-dominant herbal materials: Dendrobium officinale, a case study,” Anal. Bioanal. Chem., vol. 406, no. 25, pp. 6409–6417, 2014, doi: 10.1007/s00216-014-8060-9.
[26] Y. Deng et al., “Qualitative and quantitative analysis of specific polysaccharides in Dendrobium huoshanense by using saccharide mapping and chromatographic methods,” J. Pharm. Biomed. Anal., vol. 129, pp. 163–171, 2016, doi: 10.1016/j.jpba.2016.06.051.
[27] A. Graiff, W. Ruth, U. Kragl, and U. Karsten, “Chemical characterization and quantification of the brown algal storage compound laminarin — A new methodological approach,” J. Appl. Phycol., vol. 28, no. 1, pp. 533–543, 2016, doi: 10.1007/s10811-015-0563-z.
[28] T. L. Wong et al., “Oligosaccharide-marker approach for qualitative and quantitative analysis of specific polysaccharide in herb formula by ultra-high-performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry: Dendrobium officinale, a case study,” J. Chromatogr. A, vol. 1607, p. 460388, 2019, doi: 10.1016/j.chroma.2019.460388.
[29] L. F. Li et al., “An oligosaccharide-marker approach to quantify specific polysaccharides in herbal formula by LC-qTOF-MS: Danggui Buxue Tang, a case study,” J. Pharm. Biomed. Anal., vol. 185, p. 113235, 2020, doi: 10.1016/j.jpba.2020.113235.
[30] H. Y. Cheng et al., “Qualitative and quantitative analysis of agar in edible bird’s nest and related products based on a daughter oligosaccharide-marker approach using LC-QTOF-MS,” Food Control, vol. 132, no. August 2021, p. 108514, 2022, doi: 10.1016/j.foodcont.2021.108514.
