Trong quy chuẩn ISO/IEC 17025 cũng như Dược điển (USP, BP, Dược điển Việt Nam), việc thẩm định tính phù hợp của hệ thống (System Suitability Test – SST) và chẩn đoán sự cố thiết bị là kỹ năng bắt buộc đối với mọi kiểm nghiệm viên sắc ký.
1. Cách đọc sắc ký đồ (Chromatogram) và nhận biết tín hiệu đạt chuẩn
Một sắc ký đồ lý tưởng phải có các đỉnh tách biệt rõ ràng, chân pic hẹp và đường nền ổn định. Các thông số then chốt cần phân tích bao gồm:
• Retention time (Thời gian lưu): Thời điểm chất phân tích đi ra khỏi cột và đến detector DAD.
• Peak Area (Diện tích pic) & Peak Height (Chiều cao pic): Đại lượng tỷ lệ thuận với nồng độ chất để định lượng.
• Baseline (Đường nền): Phản ánh độ ổn định của pha động, buồng điều nhiệt và đầu dò.
• Quét phổ 3D bằng đầu dò DAD: Giúp so sánh phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến UV-Vis của pic mẫu với pic chuẩn tại mọi điểm trên đỉnh pic, từ đó xác định độ tinh khiết đỉnh (Peak Purity).
2. Các thông số đánh giá khả năng hoạt động của hệ thống (System Suitability)
• %RSD (Relative Standard Deviation): Đánh giá độ lặp lại của diện tích pic và thời gian lưu qua ít nhất 5-6 lần tiêm chuẩn lặp lại (thông thường %RSD ≤ 1.5 – 2.0%).
• Theoretical plates (N – Số đĩa lý thuyết): Đánh giá hiệu lực cột (càng lớn cột càng tách tốt, thường N > 2000 – 5000 tùy chỉ tiêu).
• Tailing factor (T – Hệ số kéo đuôi): Đo độ bất đối xứng của đỉnh (yêu cầu chuẩn thường nằm trong khoảng 0.8 ≤ T ≤ 1.5).
• Resolution (Rs – Độ phân giải): Đánh giá khả năng phân tách giữa hai đỉnh lân cận (yêu cầu Rs > 1.5 để hai pic tách rời nhau hoàn toàn đến đường nền).
3. Nhận biết và quy trình xử lý các sự cố HPLC thường gặp (Troubleshooting)
• Sự cố áp suất cao bất thường: Nguyên nhân do tắc màng lọc dung môi đáy lọ (solvent sinker), tắc cột sắc ký C18, van tiêm mẫu hoặc kết tủa muối đệm. Hướng xử lý: Kiểm tra áp suất từng đoạn, súc rửa cột bằng dung môi hữu cơ thích hợp hoặc thay màng lọc bảo vệ (Guard column).
• Sự cố áp suất thấp hoặc áp suất dao động: Do rò rỉ dung môi tại các mối nối (fitting), bọt khí trong đầu bơm cao áp hoặc hỏng van một chiều (check valve). Hướng xử lý: Purge đuổi khí, kiểm tra fitting và siêu âm làm sạch check valve.
• Pic bị kéo đuôi (Peak Tailing) hoặc dốc đầu (Peak Fronting): Do tương tác thứ cấp với nhóm silanol tự do trên silica của cột C18, cột bị nhiễm bẩn hoặc dung môi hòa tan mẫu có độ rửa giải mạnh hơn pha động.
• Pic bị chẻ đỉnh (Peak Splitting): Do đầu cột sắc ký bị tắc một phần tạo thành hai dòng chảy, hoặc khoảng trống đầu cột (void volume).
